Мікроклональне розмноження рослин: особливості та переваги методу для отримання якісного посадкового матеріалу

Вирощування рослин в культурі in vitro – це сучасний метод вегетативного розмноження рослин, який дозволяє отримати генетично однорідний, очищений від вірусів посадковий матеріал для закладання промислових плантацій ягідників, садів, насаджень енергетичних культур, масового тиражування декоративних та екзотичних рослин.

В основі методу мікроклонування лежить унікальна властивість рослинної соматичної клітини – тотипотентність, тобто здатність цих клітин реалізовувати потенціал цілої рослини.

Одні із перших успішних дослідів з мікроклонального розмноження рослин у 50-х роках ХХ сторіччя провів французький дослідник Жорж Морель, який застосував технологію культивування апікальних меристем для мікроклонування орхідей.

Мікроклональне розмноження рослин надає такі можливості:

  • Прискорити селекційний процес, завдяки чому у 5-6 разів скорочуються строки отримання товарної продукції;
  • Отримувати посадковий матеріал, ідентичний вихідному, із збереженням усіх властивостей сорту, очищений від вірусних та бактеріальних інфекцій;
  • Забезпечити рослинам активний ріст протягом всього року та захист від несприятливих абіотичних та біотичних факторів;
  • Тиражувати посадковий матеріал рослин, які складно розмножуються вегетативно, або втрачають свої властивості при генеративному розмноженні;
  • При вирощуванні рослин із тривалою ювенільною фазою можна прискорювати перехід рослин від ювенільної до репродуктивної фази;
  • Забезпечити тривале зберігання рослин в умовах in vitro, створювати банки для зберігання цінних видів рослин та їх органів;
  • Використовувати культивування рослинних тканин для отримання вторинних метаболітів (антибіотики, ферменти тощо).

Основні етапи мікроклонального розмноження рослин:

  1. Відбір рослини-донора, діагностика фітопатологій, за необхідності оздоровлення рослини.
  2. Стерилізація та введення експланта в культуру in vitro.
  3. Мікророзмноження.
  4. Укорінення пагонів.
  5. Адаптація рослин до ґрунтових умов.

Рослини-донори експлантів повинні бути протестовані на наявність вірусних, мікоплазменнових та бактеріальних інфекцій за допомогою ПЛР-діагностики, імуноферментного аналізу або молекулярної гібридизації.

Рослинам, які за результатом тестування не містять патогенів, присвоюється категорія «безвірусних» базисних клонів. У випадку виявлення інфекції рослини піддають оздоровленню.

Іноді для активного виявлення бактеріальної мікрофлори середовища збагачують органічними добавками, які провокують ріст патогенних мікроорганізмів. Через 10 днів проводять візуальну діагностику, «чисті» експланти переносять на поживне середовище для подальшого культивування.

Для кожної культури та сорту готується селективне поживне середовище, рецептура якого встановлюється науково-обґрунтованим та експериментально доведеним шляхом. Використовуються також загально відомі рецептури поживних середовища: Мурасіге-Скуга (культивування декоративних, кісточкових плодових), Уайта, Хеллера, Піріка, Кнопа тощо.

Поживні середовища для культивування рослин містять суміш мінеральних поживних речовин, сахарози, фітогормонів (ауксини, цитокініни, гібереліни) та агар-агару.

Усі роботи по уведенню рослин у культуру in vitro проводяться у ламінарному боксі, де забезпечуються стерильні умови.

Подальше зберігання рослинних експлантів відбувається у культуральних кімнатах за повністю контрольованих умов: температура, вологість, інтенсивність освітлення, тривалість фотоперіоду.

І останній, завершальний етап – адаптація мікросаджанців до ґрунтових умов, спочатку у мікропарниках шляхом висадки на спеціальний субстрат, потім в умовах теплиці.

Мікроклонування використовується для отримання посадкового матеріалу таких рослин

  • Ягідні культури – лохина, суниця, малина, ожина, жимолость
  • Кісточкові плодові рослини – вишня, слива, черешня, абрикос, персик, а також підщепи для них
  • Горіхоплідні – лісовий горіх (фундук), волоський горіх
  • Деревні та хвойні рослини (павловнія, туя)
  • Енергетичні рослини (верба, міскантус)
  • Декоративні – троянди, орхідеї, хризантеми, бегонії тощо
  • Екзотичні – банани, цитрусові
  • Лікарські та ефіроолійні – лаванда, женьшень, душиця

Клітинний цикл – визначення, фази, регуляція

Що таке клітинний цикл? – Визначення клітинного циклу

  • Процес, за допомогою якого клітина ділиться на дві дочірні клітини шляхом дублювання своєї ДНК і поділу своєї цитоплазми та органел, відомий як клітинний цикл.
  • Прево і Дюма (1824) відкрили клітинний цикл, досліджуючи процес розщеплення зиготи жаби. Щоб поділитися та створити нові клітини, клітина повинна пройти кілька етапів.
  • Клітинний цикл — це повний процес, завдяки якому нова клітинна популяція росте та розвивається за допомогою однієї батьківської клітини.

Клітина організовано проходить послідовність фаз. Фаза G1 міжфазна характеризується ростом клітин і синтезом білка, фаза S — реплікацією ДНК і реплікацією центросом, а фаза G2 — додатковим ростом клітин і синтезом білка. За інтерфазою слід мітотична фаза. Поділ ядра відбувається під час мітозу, процесу, в якому дубльовані хромосоми відокремлюються та розподіляються між дочірніми ядрами. Після мітозу зазвичай відбувається процес, відомий як цитокінез, під час якого відбувається поділ цитоплазми та утворення двох дочірніх клітин, клітина ділиться. | Джерело зображення: https://opentextbc.ca/biology/chapter/6-2-the-cell-cycle/

Фази клітинного циклу

Дозрівання клітини та наступний поділ є результатом життєвого циклу клітини, також відомого як поділ клітини. Ці процеси включають подвоєння геному, виробництво клітинних органел і поділ цитоплазми.

Клітини людини мають стандарт еукаріотична клітина цикл і пройти один раунд росту та поділу приблизно за 24 години. Однак тривалість циклу варіюється від організму до організму і від клітини до клітини. Дві основні фази нормального еукаріотичного клітинного циклу такі:

1. Інтерфаза

  • Клітина готується до клітинного поділу під час інтерфази, одночасно здійснюючи регулярну діяльність.
  • Інтерфаза – це час, коли клітина готується до поділу, проходячи як клітинний ріст, так і реплікацію ДНК. Її часто називають фазою спокою клітинного циклу.
  • Це займає приблизно 95% від загального часу циклу.
  • Для переходу клітини від інтерфази до мітотичної фази мають бути задоволені численні внутрішні та зовнішні вимоги. Три міжфазні фази позначаються як G1, S і G2.

a. Фаза G1

  • Оскільки спостерігається мінімальна зміна, початкова стадія інтерфази відома як фаза G1, або перший розрив.
  • Однак на стадії G1 клітина надзвичайно активна на біохімічному рівні.
  • Між мітозом і початком реплікації генетичного матеріалу клітини клітина перебуває у фазі G1.
  • Клітина метаболічно активна і продовжує розширюватися протягом цієї стадії без повторення своєї ДНК.

b. S фаза

  • Ядерна ДНК зберігає свою напівконденсовану структуру хроматину протягом інтерфази.
  • Сестринські хроматиди, які міцно з’єднані в області центромери кожної хромосоми, створюються в результаті реплікації ДНК під час S-фази (фази синтезу).
  • На цьому етапі кожна хромосома є дублікатом і складається з двох сестринських хроматид. У S-фазі центросома дублюється.
  • Мітотичне веретено, яке керує рухом хромосом під час мітозу, буде розвиватися з двох центросом.
  • Пара паличкоподібних центріолей, які розташовані під прямим кутом одна до одної, утворюють центросому. Поділ клітин організовано центролями.
  • У багатьох еукаріотичних видів, включаючи більшість видів грибів і рослин, у центросомах відсутні центріолі.

в. Фаза G2

  • Клітина відновлює свої запаси енергії та виробляє білки, необхідні для маніпулювання хромосомою під час фази G2, також відомої як другий розрив.
  • Щоб забезпечити ресурси мітотичного веретена, деякі клітинні органели реплікуються, а цитоскелет розбирається.
  • Під час G2 може відбуватися більша проліферація клітин.
  • Перш ніж клітина почне першу стадію мітозу, останні мітотичні приготування повинні бути завершені.

Значення фаз G1, S і G2 інтерфази

  • Клітина росте в фазі G1, але не реплікується.
  • Реплікація ДНК клітини відбувається в S-фазі.
  • Клітина виробляє РНК, білки та інші макромолекули, необхідні для мітотичного поділу під час фази G2.

2. Мітотична фаза або М-фаза

  • Цитоплазма і вміст ядра повинні бути розділені, щоб створити дві дочірні клітини.
  • Дубльовані хромосоми вирівнюються, розділяються та переносяться до протилежних полюсів клітини під час багатоетапної мітотичної фази, після чого клітина ділиться на дві абсолютно нові ідентичні дочірні клітини.
  • Ядерний поділ здійснюється під час першої з п’яти стадій мітотичної фази, яка називається мітозом.
  • Фізичний поділ цитоплазматичних компонентів на дві дочірні клітини відбувається під час другої стадії мітотичної фази, відомої як цитокінез.

Мітоз

  • Профаза, прометафаза, метафаза, анафаза та телофаза це фази мітозу, які призводять до поділу клітинного ядра.

Профаза, прометафаза, метафаза, анафаза та телофаза — це п’ять стадій мітозу тваринної клітини, які зображені тут за допомогою світлової мікроскопії та флуоресценції. Цитокінез, як правило, відбувається одночасно з мітозом, як показано на зображенні, отриманому за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа. (авторські «діаграми»: модифіковано Маріаною Руїз Вільяреал; «мікрофотографії мітозу»: редаговано Роєм ван Хісбіном; «мікрофотографія цитокінезу»: редаговано Wadsworth Center, Департамент охорони здоров’я штату Нью-Йорк; внесено до фонду Wikimedia; масштабні дані від Метта Рассела)

  • Протягом профази, «першої фази», має відбуватися кілька дій, щоб забезпечити доступ до хромосом у ядрі. Окрім того, що апарат Гольджі та ендоплазматичний ретикулум фрагментуються та поширюються на периферію клітини, ядерна оболонка починає розщеплюватися на крихітні везикули. Ядерце відходить. Центросоми починають подорожувати до протилежних полюсів клітини. Центросоми розсуваються мікротрубочками, які складають основу мітотичного веретена, коли волокна мікротрубочок подовжуються. Під світловим мікроскопом сестринські хроматиди починають згортатися щільніше і стають помітними.
  • Багато процесів, що почалися в профазі, продовжують розвиватися під час прометафази, яка завершується створенням зв’язку між хромосомами та цитоскелетом. Залишки ядерної оболонки зникають. У міру того як більше мікротрубочок організовується і поширюється на довжину попередньої ядерної області, мітотичне веретено продовжує рости. Хромосоми стають меншими і здаються більш чіткими. Кожна сестринська хроматида використовує білковий комплекс, який називається кінетохором, для з’єднання з веретеноподібними мікротрубочками в центромері.
  • Усі хромосоми розташовані в метафазній пластинці, також відомій як екваторіальна площина, яка розташована посередині між двома полюсами клітини. Сестринські хроматиди залишаються міцно злитими одна з одною. Зараз хромосоми знаходяться на найвищому рівні конденсації.
  • Центромери сестринських хроматид в екваторіальній площині розходяться під час анафази. Кожна хроматида, яку тепер називають хромосомою, швидко тягнеться в напрямку центросоми, де була з’єднана її мікротрубочка. Некінетохорні мікротрубочки ковзають одна проти одної на метафазній пластинці, де вони перекриваються, через що клітина виглядає витягнутою.
  • Усі процеси, які відбувалися протягом попередніх трьох фаз для підготовки дубльованих хромосом до мітозу, змінюються під час телофази. Хромосоми досягають своїх антиподальних позицій і починають деконденсуватися (розплутуватися). Цитоскелет кожної дочірньої клітини буде зібрано з мономерів, які відокремлюються від мітотичних веретен під час цього процесу. Навколо хромосом утворюються ядерні оболонки.

Цитокінез

  • Друга стадія мітотичної фази, відомої як цитокінез, відбувається, коли клітина ділиться на дві дочірні клітини шляхом фізичного відокремлення своєї цитоплазми.
  • Хоча більшість еукаріотів проходять ті самі етапи мітозу, рослинні клітини та інші еукаріоти з клітинною стінкою проходять цитокінез зовсім по-різному.
  • Анафаза починається після ініціації цитокінезу в клітинах без клітинної стінки, таких як клітини тварин.
  • На колишній метафазній пластинці скоротливе кільце, що складається з ниток актину, розвивається безпосередньо всередині плазматичної мембрани. Актинові нитки викликають тріщину, втягуючи екватор клітини всередину.
  • Термін «тріщина» для цього розколу — це «розколна борозна». Коли актинове кільце скорочується, борозна поглиблюється, і врешті-решт мембрана та клітина відокремлюються одна від одної.
  • Жорсткі клітинні стінки, які оточують плазматичну мембрану, запобігають утворенню борозни розщеплення в клітинах рослин.
  • Дочірні клітини повинні створити нову Клітинна стінка. Ферменти, структурні білки та молекули глюкози збираються апаратом Гольджі під час інтерфази, перш ніж він фрагментується на везикули та поширюється по всій клітині, що ділиться.
  • Ці везикули Гольджі рухаються вздовж мікротрубочок під час телофази, щоб зібратися на метафазній пластині.
  • Клітинна пластинка — це структура, яка утворюється, коли везикули зливаються там, рухаючись від центру до клітинних стінок. Клітинна пластинка зростає, коли більше везикул зливається, зливаючись із клітинною стінкою на краю клітини.
  • Глюкоза, яка накопичилася між шарами мембрани, використовується ферментами для створення нової целюлозної клітинної стінки. По обидві сторони нової клітинної стінки мембрани Гольджі перетворюються на плазматичну мембрану.

Стара метафазна пластинка тваринної клітини розвиває борозну розщеплення частково (а). Кільце актинових волокон, яке скорочується безпосередньо всередині мембрани, втягує плазматичну мембрану всередину. Клітини розщеплюються навпіл, коли борозна розщеплення поглиблюється. Стара метафазна пластина рослинної клітини є місцем, де збираються везикули Гольджі в частині (b). Везикули об’єднуються, створюючи клітинну пластинку. Від центру назовні до клітинних стінок клітинна пластинка розширюється. Вміст везикули використовується для створення нових клітинних стінок. | Джерело зображення: https://opentextbc.ca/biology/chapter/6-2-the-cell-cycle/

Що таке фаза G0?

  • Не всі клітини дотримуються загальноприйнятої схеми клітинного циклу, яка потребує свіжого виробництва дочірня клітина відразу увійти в інтерфазу, а потім швидко увійти в мітотичну фазу.
  • Фаза G0 – це коли клітина активно не готується до поділу.
  • Клітина завершила свій клітинний цикл і зараз знаходиться в стані спокою (неактивної). Деякі комірки ненадовго переходять у G0, перш ніж зовнішнє джерело сигналізує про початок G1.
  • Інші клітини, такі як зріле серце м’яз і нервові клітини, які ніколи або рідко діляться, завжди залишаються в стані G0.

Клітинні цикли in Vivo

  • нейрони, м’язові клітини або еритроцити є прикладами високоспеціалізованих клітин, які не можуть ділитися. Ці клітини залишаються в диференційованому стані, поки не зникнуть.
  • клітини, які зазвичай не діляться, але при правильних стимулах їх можна змусити почати синтезувати ДНК і ділитися. Ця група включає лімфоцити та клітини печінки, які можна стимулювати до розмноження шляхом взаємодії з потрібним антигеном або шляхом хірургічного видалення частини печінки.
  • клітини з типово помірно високим рівнем мітотичної активності. Ця група включає стовбурові клітини з кількох тканин дорослої людини, включаючи гемопоетичні стовбурові клітини, які розвиваються в червоні та білі кров’яні клітини, і стовбурові клітини в основі множинних епітеліїв, які покривають поверхню та порожнини тіла. Швидкий і постійний поділ клітин також спостерігається в порівняно неспеціалізованих клітинах апікальних меристем, які знаходяться поблизу кінців коренів і стебел рослин. Здатність до асиметричного поділу є важливою властивістю стовбурових клітин, яка не притаманна більшості інших клітин. Коли клітина ділиться асиметрично, дві дочірні клітини мають різну форму, склад або долю. Одна дочірня клітина, яка є результатом асиметричного поділу стовбурової клітини, все ще залишається незакріпленою стовбуровою клітиною, як і її батьківська, а інша дочірня клітина почала процес диференціювання в клітину цієї тканини. Іншими словами, стовбурові клітини можуть брати участь як у самовідновленні, так і в розвитку диференційованих тканинних клітин через асиметричні поділи.

Клітинні цикли в ембріонах жаби, що розщеплюються, у яких відсутні фази G 1 і G 2, можуть тривати лише 30 хвилин, тоді як у тканинах, що повільно розвиваються, таких як печінка ссавців, можуть тривати багато місяців.

Багато клітин в організмі вважаються такими, що знаходяться в стані спокою, що означає, що вони в даний момент не зазнають клітинного поділу, але все ж мають здатність це робити, якщо цього вимагає ситуація. Клітини, які припинили поділ, за деякими помітними винятками, зупиняються у фазі перед початком синтезу ДНК.

Контроль клітинного циклу

  • Навіть всередині однієї клітини організму тривалість клітинного циклу дуже різна.
  • У людини обмін клітин коливається від кількох годин під час раннього ембріонального розвитку до середнього від двох до п’яти днів для епітеліальних клітин або до повного людського життя для спеціалізованих клітин, таких як кортикальні нейрони або клітини серцевого м’яза, які проводять усе своє існування в Стан G0.
  • Кількість часу, який клітина проводить на кожній стадії клітинного циклу, також різна. Цикл триває приблизно 24 години, коли клітини ссавців, що швидко розходяться, культивуються в культурі (поза організмом за ідеальних умов росту).
  • Фаза G1 швидко діляться клітин людини з 24-годинним клітинним циклом триває приблизно 11 годин.
  • Події в клітинному циклі приурочені як до внутрішніх, так і до зовнішніх механізмів клітини.

Регулювання на внутрішніх КПП

  • Дочірні клітини повинні бути ідентичними копіями батьківських клітин.
  • Подвоєння або помилки розподілу хромосом призводять до мутацій, які можуть поширюватися на кожну наступну клітину, яка розвивається з аберантної клітини.
  • Існують системи внутрішнього контролю, які функціонують у трьох основних контрольних точках клітинного циклу, де клітинний цикл можна перервати до сприятливих обставин, що запобігає подальшому поділу пошкодженої клітини.
  • Ці контрольні точки відбуваються під час метафази, на переході G2-M і наприкінці G1.

Контрольно-пропускний пункт G1

  • Контрольна точка G1 перевіряє, чи всі обставини ідеальні для продовження поділу клітин.
  • Клітина безповоротно бере участь у процесі поділу клітини в контрольній точці G1, також відомої як точка рестрикції.
  • Геномна ДНК перевіряється на наявність пошкоджень у контрольній точці G1 на додаток до достатніх запасів і розміру клітини.
  • Клітинка не увійде в S-фазу, якщо вона не відповідає всім попереднім умовам.

Контрольно-пропускний пункт G2

  • Якщо певні вимоги не виконуються, контрольна точка G2 запобігає переходу в мітотичну фазу. Оцінюють запаси білка і розмір клітин, як і на КПП G1.
  • Основний обов’язок контрольно-пропускного пункту G2 полягає в тому, щоб переконатися, що всі хромосоми були продубльовані, а ДНК, яка була реплікована, не була пошкоджена.

КПП М

  • Ближче до завершення фази метафази мітозу має місце контрольна точка М.
  • Оскільки він перевіряє, чи всі сестринські хроматиди належним чином з’єднані з мікротрубочками веретена, контрольна точка М також відома як контрольна точка веретена.
  • Цикл не триватиме, доки кінетохори кожної пари сестринських хроматид не будуть надійно закріплені на волокнах веретена, що виникають з протилежних полюсів клітини, оскільки поділ сестринських хроматид під час анафази є незворотним процесом.

посилання

  • Ян, Н., Шерідан, А.М. (2014). Клітинний цикл. Енциклопедія токсикології, 753–758. doi:10.1016/b978-0-12-386454-3.00273-6
  • Лью, Діджей (2013). Клітинний цикл. Енциклопедія генетики Бреннера, 456–464. doi:10.1016/b978-0-12-374984-0.00206-0
  • Лью, Д. (2001). Клітинний цикл. Енциклопедія генетики, 286–296. doi:10.1006/rwgn.2001.1557
  • Вентура, Е., Джордано, А. (2019). Клітинний цикл. Довідковий модуль з наук про життя. doi:10.1016/b978-0-12-809633-8.90189-4
  • Пун, RYC (2015). Контроль клітинного циклу☆. Довідковий модуль з біомедичних наук. doi:10.1016/b978-0-12-801238-3.98748-8
  • Альбертс Б, Джонсон А, Льюїс Дж та ін. Молекулярна біологія клітини. 4-е видання. Нью-Йорк: Garland Science; 2002. Огляд клітинного циклу. Доступно з: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26869/
  • https://opentextbc.ca/biology/chapter/6-2-the-cell-cycle/
  • https://www.khanacademy.org/science/ap-biology/cell-communication-and-cell-cycle/cell-cycle/a/cell-cycle-phases